真菌荧光染色液在皮肤科门诊的真菌检查标准化流程

真菌荧光染色液技术因其高敏感性和快速性，已成为皮肤科门诊真菌检查的重要工具。建立标准化的操作流程，不仅能够提高检出率，还能确保不同操作者之间的结果一致性。本文基于临床实践和专家共识，系统梳理皮肤科门诊真菌荧光染色检查的全流程标准化规范。

一、真菌荧光染色液适用范围与临床指征

1. 适用标本类型

标本类型 常见疾病 采集部位要求

皮屑 体癣、股癣、手癣、足癣 皮损边缘活动区，避开中央消退区

甲屑 甲癣（灰指甲） 病变甲板深层，近端甲母质处

病发 头癣 断发、病发根部，毛囊口处

分泌物/脓液 念珠菌感染、马拉色菌毛囊炎 皮损表面新鲜渗出物

2. 真菌荧光染色液临床送检指征

以下情况建议进行真菌荧光染色检查：

典型体癣、股癣、手足癣等临床表现

疑似真菌感染的炎症性皮损（与皮炎、湿疹、脂溢性皮炎鉴别）

甲板增厚、变色、碎屑状改变

头皮脱屑、断发、斑片状脱发

特殊皮损（如掌跖部位的深色斑片，需与色素痣、黑色素瘤鉴别）

二、真菌荧光染色液标准操作流程（SOP）

流程概览

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患者缴费 → 标本采集 → 制片染色 → 镜检观察 → 报告出具 → 回诊解读

第一步：真菌荧光染色液检查前准备

1. 器材准备

75%医用酒精

无菌钝刀、刮勺或小镊子

载玻片、盖玻片

真菌荧光染色液

荧光显微镜（配备340-380 nm激发滤光片）

2. 患者准备

真菌荧光染色液检查前告知患者检查目的和过程

检查部位24小时内避免涂抹药膏

甲癣患者建议提前软化甲板（如温水浸泡）

第二步：标本采集（关键质量控制点）

1. 消毒与定位

使用75%酒精棉球对皮损部位进行消毒，待酒精自然挥发后采集标本。

重要：酒精消毒后可减少表面污染，但需待酒精完全挥发后再取材，避免稀释染色液。

2. 皮屑采集

部位 采集方法

体癣/股癣 用钝刀刮取皮损边缘活动区的鳞屑，以见到轻微渗血为度

手足癣 刮取指（趾）缝、足底水疱壁或鳞屑

甲癣 刮取甲板深层碎屑，靠近甲母质处更佳

头癣 用钝镊子拔取病发，或刮取断发及毛囊口内容物

3. 胶带法采集（适用于儿童或特殊部位）

对于不便刮取的部位或儿童患者，可采用透明胶带粘贴皮损区域，反复粘贴后将有标本的一面粘贴于载玻片上，再滴加染色液。

第三步：制片与染色

1. 制片操作

真菌荧光染色液步骤 操作内容 注意事项

1 将采集的标本置于洁净载玻片中央 标本量适中，不宜过多或过少

2 滴加1-2滴真菌荧光染色液 完全覆盖标本

3 盖上盖玻片 避免产生气泡

4 静置1-2分钟 使染色液充分渗透

2. 特殊情况的处理

情况 处理方式

甲屑标本 静置时间延长至3-5分钟，或轻微加热

厚层皮屑 可先滴加少量KOH软化，再加荧光染液

制片后未及时观察 置于湿盒中避光保存，2小时内观察

第四步：镜检观察

1. 显微镜设置

参数 设置要求

激发波长 340-380 nm（紫外光）

发射波长 420-480 nm（蓝光）

物镜倍数 10×、20×初筛，40×确认

2. 观察要点

荧光染色阳性表现为：真菌菌丝、孢子、芽孢呈现亮蓝色或蓝绿色荧光，背景角质呈暗淡的淡蓝色或几乎不发光。

真菌结构 镜下特征

菌丝 长条形、有隔膜、分支状

孢子 圆形或卵圆形，可单生或成簇

假菌丝（念珠菌） 串珠状排列的芽生孢子

马拉色菌 成群分布的圆形芽孢（“葡萄串”样）

3. 阳性判断标准

阳性：清晰观察到典型菌丝和/或孢子结构

阴性：未观察到任何真菌结构，背景无特异性荧光

第五步：报告出具

1. 报告内容规范

项目 内容

患者信息 姓名、性别、年龄、门诊号

标本来源 皮屑/甲屑/毛发/其他，具体部位

检测方法 真菌荧光染色法

镜下所见 菌丝/孢子形态描述

检测结果 阳性/阴性

报告医师 签名及日期

2. 结果描述规范

阳性报告：镜下见真菌菌丝及孢子（可注明形态特征）

阴性报告：镜下未见真菌菌丝及孢子

疑难标本：可注明“建议结合临床或行真菌培养”

3. 出报告时限

常规标本制片后20分钟内可出具报告。

三、真菌荧光染色液质量控制要点

1. 标本采集质量控制

控制点 标准要求

取材部位 皮损边缘活动区，避开中央消退区

标本量 足够镜下观察（约米粒大小）

污染控制 操作前酒精消毒，避免表面污染

采集器械 一次性无菌器械，防止交叉感染

2. 染色质量控制

控制点 标准要求

染色液 避光保存，开封后按说明书有效期使用

染色时间 常规1-2分钟，甲屑/厚皮屑适当延长

制片质量 盖玻片下无气泡，标本分布均匀

3. 镜检质量控制

控制点 标准要求

显微镜校准 每日开机后检查荧光光源稳定性

观察顺序 先低倍（10×）扫描，后高倍（40×）确认

阴性复核 阴性标本建议至少观察3个视野

阳性对照 定期使用已知阳性标本作为质控

4. 人员培训要求

操作人员需经过专门的真菌镜检培训

熟练掌握真菌形态学识别

定期进行室间质评和结果比对

四、真菌荧光染色液结果解读与临床决策

1. 阳性结果的临床意义

荧光染色阳性 = 真菌感染存在

确诊真菌感染，可针对性使用抗真菌药物

需结合临床判断具体菌种（荧光染色不能分型）

治疗后复查：荧光染色转阴提示疗效良好

2. 阴性结果的临床意义

荧光染色阴性 ≠ 排除真菌感染

可能原因分析：

标本采集不当（未取到活动区）

标本量不足

近期使用抗真菌药物

真菌载量低于检测限

非真菌性皮肤病

处理建议：

临床症状典型者：建议再次取材复查

高度怀疑但多次阴性者：建议行真菌培养（需2周）

结合临床表现综合诊断

3. 常见疾病阳性特征

疾病 镜下特征

体癣/股癣 透明、有隔、分支状菌丝

足癣 较多菌丝，可见孢子

甲癣 菌丝较粗短，可见关节孢子

头癣 发内/发外孢子、菌丝

花斑糠疹 成群圆形或卵圆形孢子（“香蕉”状菌丝）

念珠菌感染 假菌丝、芽生孢子

掌黑癣 棕色分支菌丝

五、常见问题与解决方案

问题1：背景荧光过强，干扰观察

原因：标本过厚、染色液过多、或存在自体荧光物质

解决方案：

减少标本量

轻轻按压盖玻片使标本铺展均匀

适当稀释染色液

问题2：真菌结构不明显或模糊

原因：染色时间不足、染色液失效、显微镜未调至正确波长

解决方案：

延长静置时间至3-5分钟

检查染色液有效期

确认激发滤光片设置正确

问题3：假阴性率高

原因：标本采集部位不当、近期用药

解决方案：

确保采集皮损边缘活动区

询问患者近期是否使用抗真菌药物

必要时行真菌培养确认

六、真菌荧光染色液流程总结与要点提示

标准化流程核心要点

环节 核心要点

标本采集 75%酒精消毒 → 取皮损边缘活动区 → 足量标本

制片染色 滴加荧光染液 → 加盖玻片 → 静置1-2分钟

镜检观察 荧光显微镜（340-380 nm激发）→ 低倍扫描 → 高倍确认

报告出具 明确描述菌丝/孢子形态 → 20分钟内完成

临床决策 阳性可确诊 → 阴性需结合临床或建议培养

质量保证关键指标

指标 目标值

标本合格率 ≥95%

染色制片成功率 ≥98%

报告及时率（20分钟内） ≥90%

阳性符合率（与培养比对） ≥80%

声明：真菌荧光染色液本文所述流程基于临床实践和专家共识，具体操作应遵循所在医疗机构的标准操作规程。对于疑难病例，建议结合真菌培养、组织病理等检查综合诊断